⾸先是质谱原理的原因，因为数据采集是DDA的模式即数据依赖性采集：是丰度排名在前20的肽段进行⼆级碎裂，所以鉴定到的肽段均是丰度⽐较高的。
丰度⾼蛋⽩酶解后的多肽，在每个保留时间都有分布，因此⼤部分时间点，都被⾼丰度蛋⽩的⾼丰度肽段占据，质谱花费⼤量时间在采集⾼丰度蛋⽩的肽段信息，⽽没有机会采集低丰度蛋⽩信息，因此导致鉴定的蛋⽩数量偏少。
⾼丰度蛋⽩会有影响鉴定数量，⾼丰度的蛋⽩会不断被采集，而低丰度蛋⽩被检测的机会降低，因此需要在前处理时将高丰度蛋白尽量多的去除掉。
①Bradford法。其原理为，蛋白质与染料考⻢斯亮蓝G-250结合，使得染料最⼤吸收峰从465nm变为595nm，在⼀定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋⽩量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进⾏蛋⽩定量。能耐受较高的还原剂，例如DTT可达5mM，但是不能耐受去垢剂如SDS要低于0.1%，去垢剂会严重影响定量结果。
②BCA法。其原理为，在碱性环境下，蛋⽩与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+（biuret reaction）。BCA与Cu1+结合形成稳定的蓝紫⾊复合物，在562nM处有⾼的光吸收值并与蛋⽩质浓度成正比，据此可测定蛋⽩质浓度。能耐受较高的去垢剂，比如SDS能达到4%，但是不能耐受还原剂，DTT必须在0.2mM以下。
因此如何选择定量⽅法主要依据蛋白溶液成分，通过稀释样本等⽅式使溶液成分都在定量⽅法的耐受范围内。
8M urea 50m M tris-HCl，蛋⽩酶抑制剂。
坚硬组织（树⽪、⽑发、老化皮肤、骨组织、指甲、昆虫壳组织、贝壳、钙化组织）；含⾼丰度蛋⽩的体液（血液、尿液、唾液、脑脊髓液、卵泡液、细胞或菌类培养基上清）；含⾼丰度蛋⽩的组织或细胞（卵细胞、肌肉组织、肌细胞相关组织、种⼦）；蛋⽩较少的组织或细胞（动物精⼦细胞、老化叶⽚、植物茎、果肉）；微⽣物、藻类（细菌真菌通常覆盖度60%或以上）。
简单样本：细胞实验蛋白，⾄少3次⽣物学重复。
复杂样本：考虑到个体差异及后期组间统计学分析，简单样本如植物、动物模型每组5个以上⽣物学重复，最少保证3个。复杂样本如（⼈的⾎液或组织样本），由于个体特异性高，建议每组30个以上样 本，最少保证10个生物学重复。如果临床样本实验⽬的为biomaker寻找，且经费有限，推荐进⾏混样。
统计学要求两组⽐较的话，至少三重复才能计算出P Value，才能知晓是否具有显著差异性；为了提升数据质量、结果产出及顺利投稿，必须注意⽣物学重复问题。
