蛋白质N-糖基化修饰是一种基础性的翻译后修饰，深刻影响蛋白质的折叠、稳定性与功能，从而影响组织发育和生理结构。然而，目前对植物蛋白质N-糖基化修饰的大部分知识来自拟南芥（一种不结肉质果实的植物）。
番茄（Solanum lycopersicum）是研究肉质果实发育的关键模式植物，选择番茄作为研究对象以阐明N-糖基化修饰在果实发育中的作用，具有重要的科学与农业意义。2025年12月，浙江大学团队于Plant Communications期刊（IF = 11.6）上发表题为“Quantitative glycoproteomics identifies target N-glycoproteins of the Golgi-class I α-mannosidase SlMNSI1 that is important for tomato fruit development”的最新研究成果，构建了番茄果实N-糖基化蛋白质组图谱，并揭示番茄果实发育关键机制。
北京青莲百奥生物科技有限公司为本研究提供质谱分析服务。
抑制剂Kifunensine (Kif)的使用会影响番茄果实的发育并导致Man9GlcNAc2积累
为探究N-糖基化修饰在番茄果实发育中的作用，研究采用MNSI酶（一类N-糖链加工酶）特异性抑制剂Kifunensine (Kif) 进行干预实验。结果表明，Kif处理会影响番茄果实的发育。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析显示，Kif处理果实中Man9GlcNAc2发生显著积累。
转录水平的表达分析表明，预测为高尔基体定位型的SlMNSI1在所有发育阶段均呈现高表达水平，并在果实从绿熟期到红熟期的发育过程中持续上调；研究选择SlMNSI1进行后续的遗传功能解析。
图1 抑制剂Kifunensine (Kif)的使用会影响番茄果实的发育并导致Man9GlcNAc2积累
SlMNSI1敲除导致多种有害发育缺陷以及Man8GlcNAc2积累
与野生型相比，SlMNSI1突变体在整个生命周期中表现出明显不同，包括种子变小、萌发率降低、植株矮化、坐果率下降、果实变小且提前成熟等。
MALDI-TOF MS分析显示，在SlMNSI1突变体中Man8GlcNAc2发生积累；而重组SlMNSI1酶能够消化SlMNSI1突变体的N-聚糖（将Man8GlcNAc2转化为Man5GlcNAc2），提示SlMNSI1发挥高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶功能。此外，SlMNSI1缺失引发果实蛋白质组学与转录组学的全局重编程。
图2 SlMNSI1敲除导致多种有害发育缺陷以及Man8GlcNAc2积累
番茄果实的N-糖基化蛋白质组学
研究采用液相色谱-（sceHCD）质谱检测技术，对完整N-糖肽开展分析；研究共鉴定到3091条完整N-糖肽，涵盖873个N-糖基化位点以及158个N-聚糖组成，分布于573个N-糖基化蛋白质上。在这158种N-聚糖组成中，有74种的结构是通过二级质谱数据、现有的聚糖结构数据库、文献以及已知生物合成途径确认的，包括9种高甘露糖，14种杂合型，42种复合型，9种贫甘露糖型。
图3 番茄果实的N-糖基化蛋白质组学
进一步分析识别SlMNSI1的候选N-糖基化修饰蛋白靶点
与对照相比，Kif处理组有643条完整N-糖肽上调，其中370条（57.5%）携带Man9GlcNAc2糖型；与野生型相比，SlMNSI1突变体中有449条N-糖肽上调，其中211条（47%）携带Man8GlcNAc2糖型；进一步分析识别出127个高置信度的共有N-糖基化位点——分布于97个N-糖基化蛋白质上——可能作为参与番茄果实发育的潜在SlMNSI1底物。功能分析显示，这些候选底物大多数被预测为分泌蛋白。
图4 进一步分析识别SlMNSI1的候选N-糖基化修饰蛋白靶点
SlMNSI1本身在N288与N334发生N-糖基化修饰
有趣的是，N-糖基化蛋白质组学数据表明SlMNSI1本身也是一种N-糖蛋白。研究在本氏烟草叶片中瞬时表达SlMNSI1-FLAG，并进行质谱分析，确认了N288与N334位点的糖基化；其中在N288位点检测到11种不同的N-糖型修饰（检测到的高甘露糖型N-聚糖包括Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man5GlcNAc2），在N334位点检测到2种不同的N-糖型修饰（检测到的高甘露糖型N-聚糖包括Man5GlcNAc2）。高尔基体加工后的Man5GlcNAc2（H5N2F0X0）在N288和N334位点均占主导，表明SlMNSI1本身在高尔基体中发生了N-糖基化。
图5 SlMNSI1本身在N288与N334发生N-糖基化修饰
N-糖基化修饰对SlMNSI1功能与果实发育至关重要
研究构建了SlMNS1蛋白质的突变体（N288与N334位点分别/同时突变为丙氨酸），并检测突变体蛋白质的亚细胞定位与稳定性。结果表明，突变体蛋白质与高尔基标志物ST-RFP在高尔基体共定位，并出现明显聚集现象。突变体蛋白质的稳定性显著低于野生型，提示N288与N334位点的N-糖基化修饰有助于蛋白质正确折叠及防止聚集。
与野生型相比，SlMNS1过表达株系与SlMNS1突变体（N288A/N334A）株系在营养生长或果实发育阶段均未表现出明显表型变化。进一步研究发现，野生型SlMNS1的过表达能够挽救突变体的果实发育缺陷，而非糖基化形式的SlMNS1过表达仅能部分互补表型；SlMNS1突变体中主要积累Man8GlcNAc2，而互补株系未出现显著变化。这些结果提示，果实发育表型并非单纯由N-聚糖谱变化引起，更可能是由于N288与N334位点N-糖基化缺陷导致SlMNS1等特定糖蛋白错误折叠、聚集及不稳定性引起。
图6 N-糖基化修饰对SlMNSI1功能与果实发育至关重要
研究总结
本研究通过化学遗传学、CRISPR-Cas9介导的基因编辑、N-糖基化蛋白质组学、遗传互补分析等，探讨了番茄高尔基体I类α-甘露糖苷酶SlMNSI1的功能。番茄果实的N-糖基化蛋白质组学鉴定到3091条完整N-糖肽，进一步分析识别出97个N-糖基化蛋白质可能作为SlMNSI1的潜在作用靶点。此外，SlMNSI1本身在N288与N334发生N-糖基化修饰；过表达野生型SlMNSI1能恢复突变体的正常果实发育，而过表达非糖基化的SlMNSI1变体体仅能部分恢复表型。总体而言，本研究揭示了SlMNSI1及甘露糖型N-糖链在果实发育中的关键作用。
参考文献
Zhao XY, Ou RH, Cui TH, et al. Quantitative glycoproteomics identifies target N-glycoproteins of the Golgi-class I α-mannosidase SlMNSI1 that is important for tomato fruit development. Plant Commun. 2025;6(12):101537. doi:10.1016/j.xplc.2025.101537
