糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病中最常见且最严重的并发症之一，也是导致终末期肾脏病（end-stage renal disease, ESRD）的首要原因。目前，蛋白尿和eGFR是诊断和监测DN最常用的临床标志物，然而这些指标存在局限性，早期发现困难，且并非DN的特异性指标。肾活检是DN诊断的金标准，但其具有侵入性、费用高、耗时长且技术要求严格等特点，此外由于肾脏损伤的异质性，活检标本可能误诊。目前尚无可靠生物标志物能预测哪些2型糖尿病患者会进展至晚期肾病，迫切需要能在蛋白尿或eGFR下降出现之前早期检测DN的新型非侵入性生物标志物。早期识别将有助于及时采取治疗干预措施，最终改善临床结局并减轻糖尿病肾病的医疗负担。
尿液因其无创采集及反映肾功能和病理状态的能力，已经成为监测肾损伤的理想诊断介质。近日，中国药科大学梁宏伟教授团队在Journal of Extracellular Vesicles（IF 14.5）发表了题为“CKAP4 in Extracellular Vesicle-Derived From Podocyte Serves as a Non-Invasive Diagnostic Biomarker for Diabetic Nephropathy and Promotes Vascular Calcification”的研究论文，文章通过高分辨率蛋白质组检测和机器学习算法，识别了具有DN诊断潜力的尿液外囊泡（urinary extracellular vesicle, uEV）相关蛋白。其中细胞骨架相关蛋白4（CKAP4）为DN无创诊断与进展监测的特异性标志物，其诊断效能优于传统指标。这一发现不仅揭示了肾-血管轴在DN并发症中的新机制，也为DN及血管钙化的防治提供了新的靶点。
北京青莲百奥生物科技有限公司为文章提供了外囊泡蛋白质学服务。
重要成果
一、EV捕获平台的开发以及蛋白质组检测
研究团队开发了一种针对尿液外囊泡的富集方法，通过小麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）偶联磁珠，高效地捕获了uEVs，并除去了样本中得大型大型微囊泡（>500nm）以及样本中的高丰度蛋白，便于后续组学检测分析。
随后，研究人员基于这一方法，针对58份尿液样本进行了uEVs富集，并通过分析蛋白质组学特征探索其作为DN潜在诊断标志物的价值。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析，结合多种机器学习算法（包括随机森林、梯度提升、偏最小二乘等），以及Limma分析鉴定的候选标志物，交叉比对发现了8种蛋白质在三种方法中共同出现，提示它们作为DN稳健诊断标志物的潜力。
图1. 鉴定uEV中候选蛋白质作为DN诊断的生物标志物
对蛋白质组数据的进一步分析显示，这8种蛋白在DN患者的uEVs中显著富集，其中CKAP4的升高最为显著。根据肾脏精准医学计划（KPMP）的单细胞RNA测序数据发现，DN患者足细胞（human podocyte cell, HPC）中CKAP4表达显著上调。因此，研究选择CKAP4进行后续深入研究。
图2. DN患者的足细胞中CKAP4表达增加
二、DN患者肾组织切片及经高糖处理的HPC中CKAP4表达均出现上调
与蛋白质组结果一致，WB显示了CKAP4在DN患者的uEVs中的高表达，而在糖尿病和其他肾病患者的uEVs中未检测到。免疫荧光染色也证实，CKAP4在DN肾脏中表达显著上调，且主要定位于足细胞。说明CKAP4上调并非糖尿病的普遍特征，而是特异性与糖尿病肾病相关。接下来，文章通过WGA偶联磁珠结合流式细胞术构建了可用于多种生物体液来源EVs的CKAP4检测方法，具有稳健的性能且能够提供可靠的定量结果。
图3. DN患者肾组织切片及经高糖处理的HPC中CKAP4表达均出现上调
三、DN小鼠模型的uEVs中CKAP4水平显著升高
为了评估uEVs中CKAP4作为DN诊断标志物的潜力，文章构建了小鼠模型进行验证。肾脏组织病理学评估可见，肾损伤从第12周开始并持续恶化。IF显示与对照组相比，肾脏CKAP4表达从第8周起逐渐增加，uEVs中的CKAP4水平也从第8周开始上升，早于尿白蛋白/肌酐比值（uACR）的升高。第20周时发现，模型小鼠uEVs中的CKAP4水平较对照组显著升高。因此这些发现支持CKAP4在uEVs中作为糖尿病肾病的早期生物标志物。
图4. DN小鼠模型中肾脏切片和uEVs中CKAP4表达随时间增加
四、uEV中的CKAP4作为DN的非侵入性诊断生物标志物
为深入探究uEVs中CKAP4的诊断潜力，文章分析了来自性别与年龄匹配队列的尿液样本，包括132例DN、187例糖尿病患者（DM）、163例非糖尿病性肾病患者（NDRD）、86例NDRD患者兼发DM（NDRD-DM）及81例健康对照。使用WGA偶联磁珠捕获CKAP4阳性uEVs，并通过流式细胞术进行定量分析，与其他组患者及健康对照相比，DN患者uEVs中CKAP4水平显著升高。ROC曲线分析显示，uEVs中CKAP4对DN诊断具有极佳的区分能力。
与DM组相比，早期DN患者uEVs中CKAP4水平已显著升高，晚期DN患者则更高。此外，uEVs中CKAP4水平与24小时蛋白尿、微量白蛋白尿呈正相关，而与估算肾小球滤过率呈负相关。CKAP4表达与肾小球硬化程度正相关，并随间质纤维化及肾小管萎缩严重程度逐步上升。DM患者中有8例因诊断或治疗需要在1年后接受了肾活检，活检前收集尿液样本定量uEVs中CKAP4水平，发现CKAP4可能能在明显功能下降之前反映亚临床肾损伤。鉴于传统标志物常滞后于组织学改变，CKAP4有望成为早期检测DN的敏感、无创生物标志物，为早期诊断和及时治疗干预提供可能。
图5. 检测uEVs中的CKAP4作为DN的诊断标志物
五、高糖处理的足细胞衍生的EVs中CKAP4可促进血管钙化
CKAP4是一种内质网膜蛋白，能调控YAP信号通路，进而上调成骨转录因子MSX2和Runx2的表达，导致钙内流和血管钙化。本文推测，在高糖条件下，足细胞分泌含有CKAP4的细胞外囊泡，这些囊泡随后被血管平滑肌细胞内化，从而激活YAP通路并促进血管钙化。为验证这一机制，研究通过高糖处理足细胞来源的EVs与血管平滑肌细胞共培养进行探讨。发现CKAP4蛋白通过EVs成功转移至血管平滑肌细胞内，而细胞内CKAP4的mRNA水平未发生改变，这表明发生了蛋白转移而非转录水平的上调。
随后的免疫学实验发现，经EVs作用后，细胞中YAP蛋白水平显著升高，作为YAP激活的下游靶点，MSX2和Runx2的mRNA及蛋白水平均上升。YAP抑制剂能有效阻断MSX2和Runx2的上调，但不影响CKAP4的蛋白水平。此外，EVs处理显著增强了血管平滑肌细胞的钙内流与钙化，而YAP抑制剂可有效抑制此效应，证实了YAP在这些过程中的介导作用。综上所述，高糖条件下，足细胞分泌携带CKAP4的EVs并被血管平滑肌细胞摄取。传递的CKAP4激活YAP信号通路，上调成骨因子表达，并促进血管钙化。这揭示了糖尿病状态下可能导致血管并发症的新型细胞间作用机制。
图6. 高糖处理的足细胞衍生的EVs中CKAP4可促进血管钙化
文章结论
本研究首次证实尿液细胞外囊泡中的CKAP4是一种新型、高特异性的生物标志物，可用于糖尿病肾病的早期无创诊断。通过将WGA偶联磁珠分离技术与流式细胞术、蛋白质组学相结合，全面解析了尿液细胞外囊泡的蛋白质组特征，并发现CKAP4是一个稳健的诊断指标。本文的研究结果不仅验证了CKAP4作为潜在诊断和预后标志物的价值，还揭示了其通过囊泡介导的信号传递在血管钙化中的功能作用。总之，这项工作凸显了基于尿液细胞外囊泡的生物标志物在推进糖尿病肾病早期诊断、风险分层和精准管理方面的转化潜力。
参考文献
Zhang H, Lou K, Qian L, Zhang M, Li J, Lv L, Lu F, He G, Wu C, Wu J, Jia M, Bai Y, Qu S, Liu M, Chu L, Wang Y, Ding D, Zen K, Yuan Y, Liang H. CKAP4 in Extracellular Vesicle-Derived From Podocyte Serves as a Non-Invasive Diagnostic Biomarker for Diabetic Nephropathy and Promotes Vascular Calcification. J Extracell Vesicles. 2025 Dec;14(12):e70208.
青莲百奥合作文章
青莲百奥深度参与众多前沿研究，与中国医学科学院、中国科学院、军事医学研究院、国家蛋白质科学中心、四川大学华西医院等顶尖科研机构通力合作，累计发表SCI论文近200篇，累计影响因子（IF）超1500。多项重磅研究成果发表于《Nature》《Science Translational Medicine》《Nature Communications》等国际顶级期刊。
