热蛋白质组学（Thermal Proteome Profiling，TPP）由德国海德堡的欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Mikhail M. Savitski教授自2014年起领导开发，融合了细胞热漂移测定（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）的原理和多重定量质谱的蛋白质组学方法，能够监测数千种蛋白质的熔解曲线。自推出以来，它已被全球药物靶点研究领域的科学家们广泛认可和推崇。
TPP技术的原理是基于配体与靶蛋白结合后，通过改变其构象、增强疏水性或形成化学交联，从而改变靶蛋白的热稳定性。这种稳定性可以通过测量蛋白质的热变性中点温度（Tm）来评估，即蛋白质解折叠50%时对应的温度。在经典流程中，细胞或细胞提取物被分为10份，分别在37-67℃的递增温度下加热，以覆盖大多数蛋白质的熔点范围。加热后提取的可溶性蛋白质通过稳定同位素标记试剂TMT10进行标记，然后混合所有样品并利用质谱技术进行数据依赖采集（DDA）分析。通过比较有无配体结合的蛋白质的Tm和熔解曲线，可以确定靶蛋白。
TPP实验原理及流程
在热蛋白质组分析（TPP）中，数据依赖性采集（DDA）结合TMT标记技术，通过多路复用样本提高了定量精度。但随着数据独立采集（DIA）技术的发展，它以更高的灵敏度和更全面的蛋白质覆盖率，以及降低的成本和简化的样品制备流程，对TMT-DDA的TPP分析方法提出了有力的挑战，特别是在需要大规模蛋白质组学研究的场合。。
2023年英国纽卡斯尔大学Maria Emilia Dueñas教授在期刊J Proteome Res（IF=3.8）上发表了题为“Comparison of Quantitative Mass Spectrometric Methods for Drug Target Identification by Thermal Proteome Profiling”的研究论文，该研究比较了TPP中的两种定量方法--TMT-DD和DIA的表现，指出在TPP实验方法时应考虑实验周期、成本、定量精度、靶点全面性等因素，以确保数据质量和分析准确性。
样本：急性髓系白血病（AML）的THP-1细胞系。
分组：药物处理组（用losmapimod处理）和对照组（DMSO处理）。
数目：8个不同的温度点（40℃, 44℃,48℃, 52℃, 56℃, 60℃, 64℃, and 68℃）进行。
重复：三次生物学重复。
数据处理：五组，分别为：TMT-DDA组、Direct DIA组、DDA library组、Hybrid library组和DIA-NN组（Library free组）。
TPP不同方法比较实验流程
TMT-DDA周期更短
对于实验人员而言，时间就是效率。在对TMT-DDA与DIA方法的全面比较中，我们发现TMT-DDA以其快速的样品准备和高效的数据分析，脱颖而出成为用时最短的方法。这对于追求实验速度和效率的科研工作者来说，无疑是个令人欣慰的选择。
TMT-DDA方法的样品准备时间大约是24小时，但质谱分析时间是75小时，使得总体时间相对较短。DIA方法的样品准备时间大约是8小时，但质谱分析时间需要96小时（涉及每个样品的单次上机（single-shot）分析），因此总体时间较长。
TPP不同方法用时比较
整体蛋白检测深度不分上下
其次关心的就是蛋白的鉴定深度了，若改变方法导致蛋白鉴定数目大幅下降，那无疑是得不偿失了。通过对不同方法的蛋白以及肽段鉴定数目的比较，发现DIA-NN在蛋白质鉴定深度上表现出色。虽然DDA与DIA的检测方法差别较大，但是所有方法之间发现了已鉴定蛋白质组的相当大的重叠，与之前的研究一致， DIA方法和TMT-DDA之间平均67%的蛋白质组是共有的。
TPP不同方法蛋白鉴定深度比较
热熔曲线拟合不分上下
在热蛋白组分析（TPP）中，蛋白鉴定数目是评估分析方法性能的一个关键指标，但并非唯一标准。研究指出，DIA-NN在低温条件下鉴定的蛋白质数目更多，而TMT-DDA在高温条件下表现更佳，而高低温的数据对于生成可靠的熔解曲线至关重要。在拟合热熔曲线时，只有满足R²≥0.8和平台值≤0.3的曲线才被纳入分析，以确保蛋白质熔点计算的准确性。TMT-DDA平均量化了4497个蛋白的曲线，而DIA-NN生成了4458条曲线，略少于TMT-DDA。此外在选择分析方法时需考虑实验设计和目标蛋白熔点的特性，以确保数据质量和分析准确性。
TPP不同方法蛋白拟合曲线比较
TMT的压缩效应
在TPP分析中，TMT标记可能会影响测量敏感度。研究以药物losmapimod的已知靶标MAPK14为例，发现DIA成功实现了从对照组的44.6 ± 0.1°C到实验组的50.0 ± 0.3°C的精确温度变化测量。相比之下，TMT-DDA方法测得的MAPK14的熔解温度比DIA平均高出0.9°C，这可能源于前体离子共分离导致的定量准确性降低，比率压缩造成的热位移测量不足，DIA方法显示出对热稳定性微小变化的高敏感性。
药物靶点MAPK14在不同检测方法中的表现
TMT-DDA热位移定量精度更佳
在评估熔解曲线的蛋白质的热位移时，研究观察到LFQ-DIA相较于TMT-DDA产生了略高的平均热位移（0.6 ± 1 °C对比-0.2 ± 1 °C），暗示了LFQ-DIA在定量上的微弱不精确性。此外，在较高温度下，LFQ-DIA在熔点测定的精度上不如TMT-DDA。DIA方法在蛋白质组成一致的样本中最为准确，因为它依赖于可比的肽段剖面进行无标记定量。在较低温度时，由于蛋白质熔解较少，DIA能提供可靠的定量结果。但在较高温度下，许多蛋白质可能已经达到其熔点，此时LFQ-DIA的定量准确性可能降低。因此，在涉及较高温度范围的实验设计中，TMT-DDA因其在准确性和可靠性上的轻微优势，应被考虑作为首选方法。
TMT-DDA热位移定量精度更佳
TMT-DDA鉴定靶点更全面
在分析不同质谱方法筛选药物靶点的能力时，研究发现TMT-DDA技术能够鉴定出DIA方法未能检测到的2个靶点。其中一个蛋白靶点的热稳定性增加，而在DIA数据中并未被捕捉到，这提醒后续研究在方法选择上需谨慎。此外，TMT-DDA还鉴定出另一个靶点，其在DIA数据中因生物重复间的高变异性而被滤除，这暗示TMT-DDA在处理噪声方面可能具有更高的容忍度。这些发现突显了在药物靶点鉴定中，不同质谱采集技术各有优势，同时也揭示了它们在数据解析上的特定局限性。
在评估TPP实验的检测方法时，尽管TMT-DDA和DIA在蛋白鉴定和曲线拟合上各有所长，但TMT-DDA以其快速的实验周期和在高温区域的高定量精度而更具优势，在热位移定量精度上略胜一筹。然而，也需注意TMT标记可能导致的压缩效应，这可能会影响Tm值的准确测量。因此，选择最佳方法时，应综合成本、实验效率、定量准确性和靶点鉴定的全面性做出选择~
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参考文献
[1] Savitski M M, Reinhard F B M, Franken H, et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome [J]. Science, 2014, 346(6205).
[2] George A L, Sidgwick F R, Watt J E, et al. Comparison of Quantitative Mass Spectrometric Methods for Drug Target Identification by Thermal Proteome Profiling [J]. Journal of Proteome Research, 2023, 22(8): 2629-2640.
