咳嗽、发热、戴口罩……提起这几个敏感词，你可能第一反应想到新冠肺炎。但有一种由结核分枝杆菌（Mtb）引起传染病，比新冠要常见得多，仅凭一己之力，就带走了全球数亿人的生命，它就是号称“白色瘟疫”的结核病（TB）。

CD8+T细胞对主要组织相容性复合体I类（MHC-I）上呈递的Mtb特异性肽的识别有助于对TB的免疫，但控制Mtb抗原在MHC-I上呈递的原理尚不完全清楚。来自麻省理工大学Forest M White和Bryan D Bryson教授团队的这篇《Immunopeptidomics reveals determinants of Mycobacterium tuberculosis antigen presentation on MHC class I》（eLife， IF=7.7）的研究论文，通过对Mtb感染的原代人巨噬细胞MHC-I的免疫肽组学分析发现，Mtb的VII型分泌系统（T7SS）的底物在MHC-I上过度表达，并揭示了多种T7SS的活性如何相互作用以促进MHC-I上Mtb抗原的呈递。

文章题目：Immunopeptidomics reveals determinants of Mycobacterium tuberculosis antigen presentation on MHC class I

发表期刊：eLife

影响因子：7.7

发表单位：麻省理工大学

研究策略

实验材料：原代人单核细胞来源的巨噬细胞；

实验方案：

1. Mtb（H37Rv）感染原代人巨噬细胞，感染72h后，通过免疫沉淀法分离MHC-I，分别通过两种方法10 kDa分子量截止过滤器以及反相C18柱分离纯化相关肽段，采用LC-MS/MS技术鉴定与MHC-I结合的肽段，包括Mtb衍生的肽段；

2. 另外使用定量、目标化的质谱（SureQuant）来量化Mtb肽段在MHC-I上的呈现，并分析ESX-1活性对这一过程的影响。

图1 免疫肽组学实验设计流程图

结果速递

一、Mtb感染的巨噬细胞的MHC-I免疫肽富含T7SS底物

通过免疫肽组学鉴定MHC-I上所展示的Mtb来源多肽，共鉴定到16种MHC-I肽段，其中13个（81.25%）来自于T7SS分泌的蛋白。Mtb基因组主要编码五种类型T7SS（ESX-1，ESX-2，ESX-3，ESX-4和ESX-5），研究发现MHC-I上的多肽主要来源于其中三种类型（ESX-1，ESX-3，和ESX-5）所分泌的蛋白。研究还发现，对于多个T7SS底物，来自同一蛋白质中的多个肽包括EsxA、PPE20、EspC、PE35以及EsxJ家族蛋白质（EsxJ、EsxK、EsxP和EsxW）中的保守序列。与整个Mtb蛋白质组相比，T7SS底物在肽段水平和蛋白质水平上MHC-I肽段库中都过表达。

图2 Mtb感染的巨噬细胞的MHC-I免疫肽富含T7SS底物

二、Mtb需要ESX-1活性来破坏吞噬体膜

为了探究Mtb抗原在巨噬细胞中如何被处理和加载到MHC-I分子上的可能机制，使用共聚焦显微镜，观察Mtb在原代人巨噬细胞内的呈递途径。实验发现，部分Mtb与Galectin-3和P62共定位，这两者分别是吞噬体膜通透性和识别细胞质暴露细菌的标记物。此外，部分Mtb也与晚期内质体和溶酶体标记物LAMP-1共定位，这表明Mtb可能接触到内溶酶体蛋白酶。然而，Mtb所在的吞噬体并没有与MHC-I本身共定位，表明Mtb抗原不太可能在含有Mtb的吞噬体内被装载到MHC-I上。这些结果暗示，进入宿主细胞细胞质是Mtb抗原处理和呈现的可能途径。进一步的研究发现，一个ESX-1分泌系统活性受损的Mtb菌株在与Galectin-3和P62的共定位减少，表明ESX-1活性对于Mtb破坏吞噬体膜是必需的。

图3 Mtb以依赖Esx -1的方式与吞噬体膜损伤标记物共定位

三、EsxA28-36和EsxJKPW24-34在MHC-I上呈递依赖于ESX-1活性

通过显微镜观察，发现ESX-1介导的吞噬体膜损伤可能是Mtb抗原进入MHC-I抗原处理途径的必要条件。使用定量的靶向质谱（SureQuant）方法来测量不同实验条件下EsxA28-36和EsxJKPW24-34两种肽段的呈现情况。研究结果表明，当巨噬细胞感染缺乏ESX-1的Mtb时，这两种肽段都不能在MHC-I上呈现。此外，还进一步探索了这种呈现是否依赖于I型干扰素信号。发现，添加外源性的IFN-β可以恢复I型干扰素反应，但并不能恢复EsxA28-36或EsxJKPW24-34在MHC-I上的呈现。这表明，这两种肽段在MHC-I上的呈现依赖于ESX-1的活性，但独立于下游的I型干扰素信号。

图4 ESX-1活性是MHC-I上呈递EsxA28-36和EsxJKPW24-34所必需的

四、Mtb肽在MHC-I上的呈递依赖于抗原加工蛋白酶

许多MHC-I肽段由蛋白酶体进行蛋白水解处理，而其他一些则由内体或溶酶体蛋白酶处理。为了确定这些机制是否对MHC-I上Mtb肽段的呈递有贡献，使用蛋白酶体活性抑制剂（MG-132）、半胱氨酸蛋白酶活性抑制剂（E64d）和溶酶体酸化抑制剂（bafilomycin）来处理巨噬细胞。结果显示Mtb肽在MHC-I上的呈现并未受到显著影响。表明Mtb肽在MHC-I上的呈递可能依赖于其他类型的抗原加工蛋白酶，或者存在多种冗余途径共同参与这一过程。

图5 抑制常规抗原加工蛋白水解途径不会损害EsxA28-36和EsxJKPW24-34在MHC-I上的呈递

研究结论

研究确定了几种能够在感染了Mtb的原代人巨噬细胞MHC-I上呈递的Mtb蛋白，可以作为结核病疫苗的靶标。通过显示T7SS底物在巨噬细胞的MHC-I中被过度表达，并揭示Mtb抗原加工的机制决定因素。该研究促进了该领域对结核病抗原呈递的理解，并为结核病疫苗的开发提出了新的潜在靶点。